帕金森?。≒arkinson's disease,PD)是最常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一, 其主要癥狀是運動功能的改變,如運動過緩、靜止震顫、步態(tài)畸形和姿勢不穩(wěn)等病變,最后導(dǎo)致運動能力喪失。流行病學(xué)調(diào)查顯示,隨著年齡增長PD患病率逐漸增高,55歲以上的人群中,帕金森病的患病率超過1%,65歲以上約為2%,是威脅老年社會人類健康的重大疾病。
小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),過度表達(dá)的野生型或突變型α-synuclein均能引起人類帕金森病的部分關(guān)鍵表型和病理特征。然而,相對小鼠而言,大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與人類更相似, 大腦更發(fā)達(dá),腦容量、表面積均比小鼠大。大鼠智力更高,對新環(huán)境易適應(yīng),有探索性,易訓(xùn)練,具備對懲罰和暗示敏感的特性,更加有利于并更廣泛地用于行為學(xué)研究和高級神經(jīng)活動的研究。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所、衛(wèi)計委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室建立了α -synA53T轉(zhuǎn)基因大鼠模型,該轉(zhuǎn)基因大鼠表現(xiàn)出中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元大量變性丟失的病理改變以及運動協(xié)調(diào)能力下降和步態(tài)障礙的行為學(xué)改變。
1. 轉(zhuǎn)基因表達(dá)α –syn A53T導(dǎo)致大鼠中腦TH陽性神經(jīng)元數(shù)目減少
酪氨酸羥化酶(TH)是多巴胺(DA)能神經(jīng)元合成的限速酶,通過檢測TH陽性細(xì)胞數(shù)目及TH蛋白表達(dá)情況可反映多巴胺神經(jīng)元功能狀態(tài)。
圖1 免疫熒光或者免疫組化檢測轉(zhuǎn)基因大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元的數(shù)目變化
WT,同窩陰性對照鼠;Tg為α –synA53T轉(zhuǎn)基因大鼠; 1M, 1月齡; 7M, 7月齡。
2. 轉(zhuǎn)基因表達(dá)α –syn A53T導(dǎo)致大鼠中腦神經(jīng)元胞漿內(nèi)α –synulcien 聚集
取7月齡轉(zhuǎn)基因大鼠及同窩陰性對照鼠中腦黑質(zhì)組織切片進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),和對照鼠相比,轉(zhuǎn)基因鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)α –synuclein 陽性著色,且和酪氨酸羥化酶(TH)陽性的神經(jīng)元共定位,提示α –synuclein在多巴胺能神經(jīng)元中特異表達(dá)(圖2)。免疫組化顯示,黑質(zhì)致密部雖無典型的路易小體出現(xiàn),但神經(jīng)元胞漿內(nèi)有大量的α –synuclein聚集,而且α –synuclein陽性黑質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)異常,較對照組中腦黑質(zhì)神經(jīng)元體積?。▓D3)。
圖2 IF檢測人α -synuclein蛋白在轉(zhuǎn)基因大鼠腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元中的表達(dá)
WT,同窩陰性對照鼠;Tg為α –synA53T轉(zhuǎn)基因大鼠;DAPI, DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole),TH, 酪氨酸羥化酶(TyrosineHydroxylase,TH);α-syn, α突觸核蛋白(α -synuclein);Merge,圖像疊加。
圖3 IHC檢測人α -synuclein蛋白在轉(zhuǎn)基因大鼠腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元中的表達(dá)
WT,同窩陰性對照鼠;Tg為α –synA53T轉(zhuǎn)基因大鼠
3. 轉(zhuǎn)基因表達(dá)α –syn A53T導(dǎo)致大鼠動作協(xié)調(diào)能力下降
選取7月齡轉(zhuǎn)基因大鼠和同窩陰性對照鼠分別進(jìn)行Rotating rod實驗,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大鼠較陰性對照大鼠在轉(zhuǎn)棒儀上運動時間減短,動作協(xié)調(diào)能力下降(圖4)。
圖4 7月齡轉(zhuǎn)基因大鼠Rotating rod實驗
WT,同窩陰性對照鼠;Tg為α –synA53T轉(zhuǎn)基因大鼠。
4. 轉(zhuǎn)基因表達(dá)α –syn A53T導(dǎo)致大鼠步態(tài)障礙
7月齡轉(zhuǎn)基因大鼠(n=8)和同窩陰性對照鼠(n=5)步態(tài)實驗結(jié)果顯示,與對照組比,轉(zhuǎn)基因組前肢步寬、后肢步寬、左前擺時長、左后擺時長、右前擺時長、左后足跡最大面積和右前足跡最大面積等7項指標(biāo)有顯著性的變化(表1)。
表1 7月齡轉(zhuǎn)基因大鼠步態(tài)實驗
步態(tài)指標(biāo)
gait parameters |
Wt
(n=5) |
A53T
(n=8) |
指標(biāo)變化
(%) |
P值 |
前肢步寬(mm) |
21.00±6.47 |
31.07±8.20 |
47% ↑ |
P<0.01 |
后肢步寬(mm) |
25.00±2.31 |
35.17±9.26 |
34% ↑ |
P <0.05 |
左前擺動時長(s) |
0.144±0.006 |
0.128±0.010 |
11% ↓ |
P <0.05 |
左后擺動時長(s) |
0.123±0.006 |
0.108±0.011 |
12% ↓ |
P <0.05 |
右前擺動時長(s) |
0.14±0.003 |
0.12±0.010 |
14% ↓ |
P <0.01 |
右后擺動時長(s) |
0.12±0.010 |
0.11±0.007 |
8% ↓ |
P >0.05 |
左后足跡最大面積 |
263.44±24.93 |
160.40±18.34 |
39% ↓ |
P <0.05 |
右前足跡最大面積 |
197.11±71.70 |
164.78±60.71 |
16% ↓ |
P <0.01 |
注:↑, 增加; ↓, 減少。
參考文獻(xiàn)
1. 張麗;陳煒;張旭;孫秀萍;楊亞軍;張連峰。攜帶A53T突變?nèi)?alpha;突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因帕金森病大鼠模型的建立。中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(10):1-6.2。
2. 張麗;張連峰。α突觸核蛋轉(zhuǎn)基因帕金森疾病模型和致病機(jī)制研究進(jìn)展。中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(11):63-67.